前言
拷貝數變異（copy number variation ,CNV）是指基因組上某些大片段的拷貝數增加或減少，可分為缺失（deletion）和重復（duplication）兩種類型。CNV是一種基因組結構變異，可通過改變基因劑量和轉錄結構等來調節有機體的可塑性，是個體表型多樣性和群體適應性進化的主要遺傳基礎之一。在基因組中，CNV的變異形式主要包括單個片段的倍增、缺失和多次重復，其中，最常見的形式是單個片段重復（segmental duplication, SD）,其在不同拷貝之間的序列同源性大於90%。通過種內比較基因組學分析，可挖掘對表型有顯著效應的CNV。目前定義的CNV長度為50 bp~5 Mb的基因組序列的插入或缺失變異。
圖1 CNV類型示意圖[1]
CNV常見的檢測方法主要分為兩類：全基因組范圍內檢測未知CNV和定點檢測已知CNV。基因組未知CNV常用的檢測方法有芯片法和測序法。芯片法主要包括比較基因組雜交芯片（aCGH）和SNP芯片（single nucleotide polymorphism arrays）。DNA測序法主要包括全基因組測序（WGS）和單分子長讀長測序（long reads sequencing）。
研究表明，不少人類復雜疾病，動植物的重要經濟性狀都和CNV有密切關系。相比單鹼基SNP變異，CNV的長度更長，覆蓋更大范圍的基因序列，可通過改變基因的劑量效應等影響與基因相關的表型。隨着全基因組測序准確性的提高、信息量的擴大、成本的下降等，高通量大規模CNV檢測得以迅速發展，並且隨着GWAS方法的不斷完善，為基於CNV-GWAS發掘更多更可靠的重要形狀相關的功能CNV提供了條件，可為后續功能CNV的分子機理以及在育種中的應用奠定基礎。
下面就對這些分析點進行詳細介紹。
常見分析內容
1.CNV檢測結果及統計
用柱狀圖顯示不同類型的CNV在不同片段長度的分布情況。如圖2所示，灘羊CNV分布大約48.5%的CNV片段在10KB-50KB之間，CNV片段在50KB-100KB之間的占比是21.7%。CNVRs片段在10KB-500KB之間的占比是86.2%。大於1MB的CNVR很少，占比0.8%。
圖2 灘羊CNV變異分布統計
2.CNVR全基因組圖譜
CNV區域（CNV Region, CNVR）是指不同個體間檢測得到的CNV具有一部分重疊區域，把重疊的CNV進行整合，合並成為一個CNVR。如圖3所示，將47頭牛的CNV進行合並，共確定1043個CNVRs，共覆蓋44.63 Mb，約占普通牛基因組序列的2.06%。已知染色體上CNVRs的分布如圖3所示，共有702個是缺失類型（Loss），270個是插入類型（Gain），71個是屬於復雜類型（Both， CNVR中同時含Gain和Loss）。Loss型CNV的數量約是Gain的2.6倍。就長度而言，最長的CNVR長度為2,111,937 bp，最短的CNVR長度為3,600 bp。Loss型CNV的數量約是Gain的2.6倍。就長度而言，最長的CNVR長度為2,111,937 bp，最短的CNVR長度為3,600 bp。該研究為荷斯坦奶牛繪制了准確的全基因組CNVRs圖譜。
圖3 CNVRs的全基因組圖譜[2]
注：藍色-插入，紅色-缺失，綠色-復雜
圖4 CNVRs密度圈圖
注：粉色-缺失，紫色-插入，藍色-復雜，深灰色-SNP，淺灰色-大片段插入
3.群體遺傳結構和遺傳多樣性
為了研究山羊屬的系統發生關系，基於全基因組常染色體上的SNP計算了兩兩個體之間的遺傳距離。利用NJ法構建了系統發育樹（圖5 B），結果顯示伊朗野山羊（bezoar）與家羊分成兩大枝，並且家羊群體按地理來源聚類。利用ADMIXTURE軟件對bezoar和家羊群體進行遺傳結構分析（圖5 C），當k＝3時，bezoar與家羊群體分為3大譜系；當k＝6時，家羊群體分為4大譜系。為了細化家羊群體內部的遺傳結構，利用家羊群體SNP進行PCA分析（圖5 D），結果顯示：PC1和PC2將家養群體按地理來源分成4個亞群，分別為歐洲家山羊群體（EUR）、非洲家山羊群體（AFR）、西南亞家山羊群體（SWA-SAS）和東亞家羊群體（EAS）。
圖5 bezoar和世界家羊樣本地理來源分布圖和群體遺傳結構分析
4.基於CNVs的GWAS分析
基於性狀和CNV基因型，應用多種模型進行GWAS分析，完成不同模型的GWAS分析后，通過QQ plot比較不同模型下實際Pvalue與理論Pvalue的分布，判斷最優分析結果。獲得最優模型后，多重檢驗校正確定Pvalue的顯著性閾值，篩選顯著區域，並篩選CNV關聯的位點基因。獲得候選基因后，進行功能注釋和富集分析。
基於仔豬存活的遺傳率和CNV進行GWAS分析，如圖6，共檢測到16個區域，分別在2、3、4、11、12、13、14、15、16和17號染色體上，可解釋22.54%的遺傳表型。
圖6 存活的仔豬數量性狀GWAS分析曼哈頓圖[3]
在SSC2，SSC3，SSC12和SSC17上確定了GWAS和CNVR分析的顯著區域，總共包含56種編碼基因。這些基因通過基因劑量的變化影響仔豬存活的數量（表1）。
表1 顯著區域的基因注釋表
5.選擇清除與環境適應性位點挖掘--Vst分析
Vst分析是類似於Fst的一個指標，用來衡量群體間每個CNVR差異大小的統計量，計算方法為Vst＝（Vt－Vs）/Vt，其中Vt表示所有樣本該區域拷貝數大小的標准差，Vs表示兩個群體各自的標准差根據各自群體大小加權之后的值。Vst的值介於0-1之間，值越大表示群體間該區域拷貝數變異差異越大，反之則越小。如圖7所示，CN vs WL的Vst平均值是0.11，CN vs RIR的Vst平均值是0.11，WL vs RIR的Vst平均值是0.15，說明WL vs RIR顯示出最高的分化程度，並且篩選Vst＞0.79的CNVRs中的基因，並進行功能注釋與富集分析，GO富集分析顯示主要涉及器官發育，代謝和免疫調節。該研究有助於了解家禽在CNV水平上的遺傳特征，這可能為開發雞的繁殖提供有用的信息。
圖7 不同分群雞的基因組Vst值曼哈頓圖[4]
6.選擇清除與環境適應性位點挖掘--Bayescan分析
Bayescan用bayes的方法和Fst的經驗分布檢測outlier標記的方法，一般應用於地理等分群信息明確的比較組差異位點的選擇分析中。本研究中，結合材料的分群信息，使用bayescan進行差異位點的檢測，檢測完成后使用R腳本進行迭代收斂情況評價和outliers的篩選，並將outliers作為候選CNVRs。Bayescan outliers檢測結果如圖8所示：
(a)將所有基因座的Fst值與BayeScan的log10（q value）作圖。垂直虛線表示log10（q value）的q＝0.05，右邊的點表示受選擇的顯著的CNVRs；
(b)按分群進行BayeScan的差異位點檢測和outliers的篩選。
圖8 Bayescan outlier檢測結果[5]
CNV介紹就分享到這里，后續再分享CNV的綜合案例應用。
參考文獻
[1]. Clinical implications of copy number variations in autoimmune disorders FAU - Yim, Seon-Hee FAU - Jung, Seung-Hyun FAU - Chung, Boram FAU - Chung, Yeun-Jun. Korean J Intern Med, 2015. 30(3): p. 294-304.
[2] Liu, M., Fang, L., Liu, S. et al. Array CGH-based detection of CNV regions and their potential association with reproduction and other economic traits in Holsteins. BMC Genomics 20, 181 (2019).
[3] Stafuzza, N.B., Silva, R.M.d., Fragomeni, B.d. et al. A genome-wide single nucleotide polymorphism and copy number variation analysis for number of piglets born alive. BMC Genomics 20, 321 (2019).
[4] Seol D, Ko BJ, Kim B, Chai H-H, Lim D, Kim H. Identification of Copy Number Variation in Domestic Chicken Using Whole-Genome Sequencing Reveals Evidence of Selection in the Genome. Animals. 2019; 9(10):809. [5] Kvist L, Honka J, Niskanen M, et al. Selection in the Finnhorse, a native all‐around horse breed[J]. Journal of Animal Breeding and Genetics, 2020.