在我之前的帖子單細胞分析實錄(7): 差異表達分析/細胞類型注釋里面，我已經介紹了如何使用SingleR給單細胞數據做注釋，當時只講了SingleR配套的參考集。這次就講講如何使用自己定義/找到的基因集做注釋，使用場景還是比較多的，比如想根據某篇論文里面的注釋結果，給自己的數據做注釋。本文配套的視頻講解已上傳到B站，新手UP: TOP菌。gongzhong號后台回復20211023可獲取本文所用到的示例數據和代碼。
本次演示用到的數據集來自2020年發表在Nature Genetics的一篇結直腸癌研究。文中用到了韓國患者(SMC)和比利時患者(KUL3)兩套數據集，兩套數據平行分析，相互印證。
我以里面的髓系細胞為例，用KUL3數據集中的髓系細胞為參考，來注釋SMC里面的髓系細胞
兩套數據集中髓系細胞部分的數據，已經跑完Seurat標准流程並整理成rds文件：SMC_mye.rds和KUL3_mye.rds。代碼存放在0.R中，這里就不展示了，很簡單。代碼中fread()用於快速讀取4G矩陣文件是可以學習的地方。
mat=fread("GSE132465_GEO_processed_CRC_10X_raw_UMI_count_matrix.txt",select = c("Index",SMC.mye.anno$Index))
之后就是創建參考集，被存儲為SummarizedExperiment對象
library(Seurat)
library(tidyverse)
library(SummarizedExperiment)
library(scuttle)
KUL3_mye=readRDS("KUL3_mye.rds")
屬性數據框中主要用到cell index和cell annotation這兩個信息，此外還需導入表達矩陣
KUL3_mye_count=KUL3_mye[["RNA"]]@counts
pdata=KUL3_mye@meta.data[,c("Index","Cell_subtype")]
rownames(pdata)=pdata$Index
pdata$Index=NULL
colnames(pdata)="ref_label"
KUL3_mye_SE <- SummarizedExperiment(assays=list(counts=KUL3_mye_count),colData = pdata)
#創建SummarizedExperiment對象
KUL3_mye_SE <- logNormCounts(KUL3_mye_SE)
#Compute log-transformed normalized expression values，要有這一行，對於單細胞數據normalize之后會再算一個log
saveRDS(KUL3_mye_SE,"KUL3_mye_SE.ref.rds")
log normalize之后就多了一個logcounts的assay，singleR的官網示例都是基於logcounts這種數據
將這個參考對象保存為rds文件，方便以后多次調用
現在導入我們的待注釋數據集和參考數據集
library(tidyverse)
library(Seurat)
library(SingleR)
library(scuttle)
library(SummarizedExperiment)
KUL3_mye_SE=readRDS("KUL3_mye_SE.ref.rds")
SMC_mye=readRDS("SMC_mye.rds")
SMC_mye_count=SMC_mye[["RNA"]]@counts
#需要取不同數據集的基因交集
common_gene <- intersect(rownames(SMC_mye_count), rownames(KUL3_mye_SE))
KUL3_mye_SE <- KUL3_mye_SE[common_gene,]
SMC_mye_count <- SMC_mye_count[common_gene,]
#也要創建SummarizedExperiment對象，以及log normalize
SMC_mye_SE <- SummarizedExperiment(assays=list(counts=SMC_mye_count))
SMC_mye_SE <- logNormCounts(SMC_mye_SE)
#注釋代碼
singleR_res <- SingleR(test = SMC_mye_SE, ref = KUL3_mye_SE, labels = KUL3_mye_SE$ref_label)
#導出注釋結果
anno_df <- as.data.frame(singleR_res$labels)
anno_df$Index <- rownames(singleR_res)
colnames(anno_df)[1] <- 'ref_label_from_KUL3'
#將注釋信息添加到Seurat對象
SMC_mye@meta.data=SMC_mye@meta.data%>%inner_join(anno_df,by="Index")
rownames(SMC_mye@meta.data)=SMC_mye@meta.data$Index
DimPlot(SMC_mye, reduction = "tsne", group.by = "Cell_subtype", pt.size=2)+
DimPlot(SMC_mye, reduction = "tsne", group.by = "ref_label_from_KUL3", pt.size=2)
左圖是原文給的注釋，右圖是依據KUL3來注釋SMC數據集，可以看出還是有一些不一致的。
像這種依據某個參考集來做注釋，對參考集質量要求很高，原文KUL3只有兩千髓系細胞，考慮到10X單細胞數據的稀疏性，這個數量是不夠的。也可能是軟件的限制，在做小類注釋時，類與類之間的表達特征其實是比較相似的，軟件不一定能精確給出合適的label，相比之下，軟件做大類注釋一般比較准。
因水平有限，有錯誤的地方，歡迎批評指正！