從16世紀末開始，，科學家們就一直使用光學顯微鏡探索復雜的微觀生物世界。然而，傳統的光學顯微由於光學衍射極限的限制，橫向分辨率止步於 200 nm左右，軸向分辨率止步於500 nm，無法對更小的生物分子和結構進行觀察。突破光學衍射極限，一直是科學家們夢想和追求的目標。
雖然隨着掃描電鏡、掃描隧道顯微鏡及原子力顯微鏡等技術的出現，實現納米級的分辨率已經成為可能，但是以上這些技術存在對樣品破壞性較大，只能觀測表面等缺點，並不適合生物樣品，特別是活體樣品的觀測。近十幾年來，一系列適合生物樣品成像的超分辨成像技術應運而生，包括結構光照明（SIM），受激發射損耗熒光顯微技術（STED），光激活定位顯微技術（PALM），隨機光學重建顯微技術（STORM）等等。在接下來幾期前沿顯微成像技術專題中，我們將為大家做詳細介紹。
光學分辨率極限
光以波的形式傳播，當一個點光源通過透鏡在成像面聚焦為一個小光點時，不管物鏡有多好，成像光點都會比實際的發光點大。這是因為光波在物鏡光闌的邊緣會發生衍射，將波前向外擴散（圖1）。
圖1 發射熒光在物鏡孔徑邊緣發生衍射
衍射光斑有一個明亮的中心點，以及環繞它的一系列亮度漸弱的衍射環，稱為艾里斑。當兩個點過於靠近，所成的像斑重疊在一起，就分辨不出是兩個點的像了。因此，光學分辨率存在一個極限。根據瑞利判據，當一個艾里斑的中心與另一個艾里斑的第一級暗環重合時，剛好能分辨出是兩個點所成的像（圖2）。用公式表示如下：
d = 1.22λ / 2NA
d表示分辨率，λ是發射光的波長，NA是物鏡數值孔徑。
圖2 光學分辨率極限示意
以GFP為例，λ=510nm，采用NA=1.4的物鏡，光學分辨率的極限就是222nm。但是在生物系統中，膜蛋白，轉運蛋白和核糖體等亞細胞結構往往小於50 nm，而且通常不會間隔足夠遠。這樣一來，就不可能直接對其進行清晰的成像。
怎么辦呢？科學研究的腳步當然不可能止步於此。為了克服衍射極限，研究人員開發了一系列超分辨成像方法。在本期中，我們將首先為大家介紹單分子定位超分辨顯微成像技術~
這種超分辨顯微技術都是通過選擇性地打開和關閉單個熒光基團，確保成像區每次僅有少量、隨機、離散的單個熒光分子發光，再通過高斯擬合，定位單個熒光分子(點擴散函數)的中心位置（圖3），以實現高精度的空間定位，最后將系列圖片疊加合成一幅超分辨圖像。
圖3 通過高斯擬合進行定位
不同的技術所使用的“開關”熒光的方法不同，下面我們就來看看它們各自的原理和特點吧~
光激活定位顯微技術（PALM）
PALM (Photoactivated Localization Microscopy)由Eric Betzig和Harald Hess於2006年首次發表於《Science》。它的原理其實非常簡單，一句話概括就是通過“開關”與目標分子結合的光激活熒光蛋白，對其進行分批定位，確定中心光斑的位置。
光激活熒光蛋白PA-GFP是綠色熒光蛋白的變種，可以被適當波長（405nm）的激發光激活。實驗時首先隨機激活一部分熒光蛋白，再用488nm激發熒光，就可以只采集一部分目標分子的熒光信號。熒光蛋白被激活的概率與激發光的強度成正比，只要激活的蛋白足夠少，相距足夠遠，就可以對其進行定位。完成數據采集后，對這些熒光蛋白進行光漂白直至完全失活，然后再激活另一些熒光蛋白進行定位。重復這個過程，就可以將樣品中的所有目標分子定位，將這些原始數據合並，就能得到目標分子的超分辨圖像。
Betzig等人在文章中將PALM與全內反射熒光顯微鏡（TIRF）進行了比較（圖4）。可以看到PALM對於熒光分子的定位精度遠高於TIRF。
圖4 TIRF（A）和PALM（B）對溶酶體膜的成像效果比較（Betzig et al., 2006）
隨機光學重建顯微技術（STORM）
STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 由華人科學家庄小威等人同樣於2006年發表於《Science》雜志。它的基本原理與PALM類似，不同的是STORM使用合成的光轉換熒光染料，而不是光激活熒光蛋白與目標分子結合。那么它是如何控制熒光的開關的呢？
熒光染料被激發進入發射態，之后會進入暗態（Dark state），在暗態中它們將與自由氧結合，進入漂白狀態。在漂白狀態下，染料不會再次發出熒光。如果不讓染料與自由氧結合，它將無法進入漂白狀態，一直維持在暗態。高功率的激發光可以使染料從暗態再次進入發射態。這種從亮到暗再到亮的狀態切換看起來就像是染料在“閃爍”一樣。
和PALM一樣，STORM也是通過隨機的分批“點亮”目標分子來進行超分辨定位（圖5）。由於消除了光漂白步驟，STORM可以更快地采集數據。不過，STORM高度依賴於熒光染料的特性：既需要產生足夠強的信號，同時又要有良好的閃爍密度。如果染料閃爍得太快，相鄰的分子之間可能會有很多干擾，無法定位單個分子；但是如果它們閃爍得太慢，可能無法獲得足夠的圖像來定位每個分子。STORM最初使用的染料是cy3和cy5，不過目前最流行的是Alexafluor 647。
圖5 哺乳動物細胞微管和CCP的雙色STORM成像（Bates et al., 2007）
DNA-PAINT
DNA-PAINT (DNA-Based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) 是一種比PALM和STORM更新的技術，由Ralf Jungmann等人於2014年發表。它的原理是利用DNA鏈的互補性產生類似於熒光分子閃爍的效果。
在DNA-PAINT中，雙螺旋DNA鏈的其中一條與目標分子相連，作為“對接”鏈，另一條被熒光標記，作為“成像”鏈。由於DNA鏈彼此之間是高度特異性結合的，因此成像鏈和對接鏈在溶液中會自發結合，在焦平面上產生單分子熒光。通過調整成像鏈的結合強度和濃度，可以反復產生瞬時結合，獲得類似STORM中熒光染料的最佳閃爍速率。對獲得的數據進行重建，就可以得到最終的超分辨率圖像（圖6）。
除了可調控的結合速率外，DNA-PAINT的另一個顯著優點是任何熒光染料都可以用於成像 鏈，便於進行多色成像。
圖6 DNA-PAINT獲得的Hela細胞微管 (綠色) 和線粒體 (洋紅色) 的雙色超分辨率圖像（e）和相同區域的衍射極限圖像（f）效果對比（Jungmann et.al., 2014）
PALM，STORM等單分子定位超分辨顯微成像技術自誕生以來，被廣泛的應用到了各種研究領域，極大地增強了定位亞細胞結構與探索它們之間相互關系的能力。譬如對局部粘着復合物及其分布進行納米尺度的成像，細胞骨架中細微結構的成像等。