我們上幾期的真相系列文章討論了信噪比(做成像的你不能不了解的真相3 - 信噪比1；做成像的你不能不了解的真相3 - 信噪比2) 和灰度值與電子數的換算（增益Gain, 灰度值與電子數-做成像的你不能不了解的真相4）。本期我們以Image J 為例，討論一下怎樣使用圖像分析軟件，對圖像的信噪比進行定量分析。
理論上說，信噪比是對每個像素亮度變化的統計分析。即使在相同條件下拍照，由於噪聲的存在，同一像素的亮度是變化的。測量信噪比，需要在同樣條件下拍攝多張圖像，然后對感興趣的像素在這一系列圖像中的亮度做統計分析: 這些亮度的平均值為信號，標准方差為噪聲。
然而，現實中我們通常只有一張圖像，以上的分析很難實現。以下我們討論只有一張圖像時，簡化的信噪比分析方法。
01感興趣區域(ROI) 的直方圖統計分析
當感興趣區域(ROI)內的信號均勻時，這個區域內的像素亮度的平均值代表信號，標准方差代表噪聲。當這個區域的像素有足夠數量時，比如100個或以上，即使只有一張圖像，分析的結果和上述使用多張圖像的分析結果相同。
例1
測量一台相機的偏置 （offset）和讀出噪聲（read noise）。我們把顯微鏡的光設置為全部到目鏡，或者蓋上相機的鏡頭蓋，用很短的曝光時間(比如1ms)，這張圖像中僅含偏置offset和讀出噪聲 read noise，沒有信號，稱為Bias圖像。
顯然，此時滿足以上我們說的分析區域的信號均勻的條件。那么，只要測量這張圖像上所有像素的亮度平均值和標准偏差，我們就能得到想要的結果了。
打開Image J， Analyze –> Histogram (直方圖)。 這時我們看到的Histogram 窗口中 Mean 就是信號平均值(此時為offset)， Std.Dev 就是噪聲(此時為讀出噪聲)。 當然，這里的單位還是灰度值(ADU)。我們需要知道此時的增益 (Gain)， 就能把讀出噪聲換算成以電子數為單位了。Offset 通常習慣就用ADU的值。 此例中，相機Gain = 0.21e-/ADU，因此：
讀出噪聲 = Std.Dev * Gain = 8.279 * 0.21 = 1.74 e-.
分析以下圖像黃色的感興趣區域的信噪比。我們已知這個區域亮度是均勻的，首先使用Image J的ROI工具定義該區域。ROI可以是矩形，圓形，任意多邊形，甚至可以是一條線段。
這個例子使用矩形比較合適。定義好ROI后，使用以上描述的方法，可以得到mean為586，Std.Dev 為47.8。
已知相機的offset為103，以上ROI區域信噪比為：(587-103) / 47.8 = 10.12
注意，因為是比值，沒有換算為電子數，對結果沒有影響。
那這個區域信號的電子數是多少呢？因為Gain = 0.21e-/ADU，所以：
信號 = (587-103)*0.21 = 101.6 e-
之前說過，當圖像工作在光子信號噪聲限制區(Shot Noise Limited)時，信噪比等於信號電子數的平方根，即
和統計分析得到的結果符合，是不是很神奇?
再換個角度驗證這個方法的正確性。上面的圖像我們實際拍攝了100幀。同樣使用Image J，我們隨機定義黃色區域內的某一個像素為ROI(只有一個像素的ROI)，然后用Image >Stacks> Plot Z-axis Profiles。
得到100張圖像中這個像素的亮度數據如下。
點擊這個曲線圖下方的More-Copy All Date， 可以把數據復制到excel做統計分析。
以下是隨機選取的4個點的結果。 可見，對亮度均勻的ROI， 使用多張圖法和單張圖法得到的結果是一致的。
以上方法，大家仔細想想就知道，需要ROI內包含一定數量的像素。像素個數越多，得到的結果越准確。給個參考值，大概100個像素就很好了。
強調一下，這種方法適合ROI亮度均勻的情況。當分析區域的信號不均勻時，比如樣品結構變化，計算出的標准方差不僅包含噪聲，也包含樣品結構信息，這時就不能使用上述方法了。
02線形強度(Line Profile)統計分析
如果把線(line)也作為一種特殊的ROI， 這個方法其實和上面的方法沒有本質區別。我們知道，有些實際的圖像，感興趣的區域可能是線形的。比如下圖，想分析線形結構的信噪比，如黃色曲線標出的部分。
Image J 的ROI定義工具可以定義直線，折線或自由曲線，如下圖:
定義好線后，選 Analyze >Plot Profile
我們就能得到下面的亮度曲線圖。點這個圖左下方的List，還能得到右邊的數據表。
在Plot 曲線窗口，選More> 同樣可以把這些數據復制粘貼到excel做統計分析，得到這條曲線下的像素點的mean和Std.dev 值， 從而計算出SNR。
和ROI直方圖方法類似，這個分析也要求線段有一定長度，越長測量結果的統計意義越好。
在實際評價圖像時，我們也經常使用這個Line Profile工具， 快速對圖像的信噪比有個大致的了解。如下圖，從左到右，圖像信噪比提高。相應的Line Profile表現為高頻成分減小。
或者，做相機靈敏度對比：中間的Line Profile曲線，清楚的體現了左右兩種相機的靈敏度差別。
03通過測量小區域的平均亮度，使用理論公式計算
如果要分析的對象，均勻的ROI或較長的Line都比較難定義，如下面圖像上亮的塊狀或點狀區域，這時可以先測量小的ROI的平均亮度，換算為電子數，再通過理論信噪比公式來計算。
關於理論信噪比公式，這里我們來復習一下:
同樣，使用ROI工具，定義ROI。
這次，我們使用Analyze > Measure 工具
每次測量可以得到右邊窗口的一行結果。可以多次對多個區域測量。
這次我們只使用mean值，因為此時ROI 太小，Std.Dev沒有准確的統計意義。以上得到的mean的單位為ADU，乘以Gain后換算為電子數。如果強度足夠大(比如對sCMOS相機>50e-)，能肯定相機在光子信號限制區域(因為讀出噪聲<2e-)， 直接計算平方根就得到SNR了。注意，計算時要先減去offset。
如果信號比較弱，在Read Noise 限制區或過度區，比如我們前面例子的相機，如果信號在10e- 以下，最好把讀出噪聲計算在內，用我們用過的完全的公式:
當然，這個方法有一定誤差，因為使用的樣本點較少，得到的平均值精度受影響。所以在允許的情況下，應該盡量把ROI定義大一些。
以上我們討論了基本的信噪比分析方法。希望能對你的工作有幫助。到此我們的不能不了解的真相系列文章也告一段落了。請繼續關注我們后續的相機技術文章。