建庫原理


濕實驗好久沒做,防止基礎知識不牢固,最近看到一篇建庫的文章,覺得不錯,搜集如下:

轉載自知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/25190448

 

Illumina 平台二代測序文庫構建原理簡介

Illumina 平台二代測序文庫構建原理簡介

來一波Illumina二代測序文庫構建原理介紹。一個制備好的Illumina二代測序文庫就是含有一堆雙鏈DNA的海洋,其中每一段DNA的5‘和3’部分的序列都是固定的(adapter),而中間的序列是可以隨便變化的。所以測序文庫的構建就圍繞着如何給未知序列的上下游加上特定的adapter而展開的。Illumina 最經典的建庫原理如圖1所示:首先將DNA整理成雙端都是blunt ends的形式,然后再用酶給3'端加上一個A(還記得taq酶的PCR產物可以直接和T載體連接吧,一回事),之后就是用TA連接方法加上Y形adapter,最后用PCR將文庫擴增並回收后就可以上機測序了。這個Y形adapter可是很有創意,當時看懂這個的時候感覺五體投地,簡直是高。

 

圖1. 圖片來源: TUFTS - TUCF Genomics

 

接下來介紹一種最近興起的建庫方法,基於Tn5轉座子的建庫方法。具體的不同如圖2所示: 首先就是用Tn5酶將adapter連接到DNA雙鏈中,這樣兩個Tn5插入就可以形成一個完整的文庫,之后就用酶將Tn5插入導致的gap修復好,然后經過PCR完成文庫擴增。

圖2. 圖片來源: A simple and novel method for RNA‐seq library preparation of single cell cDNA analysis by hyperactive Tn5 transposase

Tn5本身是一個DNA轉座子的轉座酶,它可以帶着自己的DNA在基因組上到處插入,研究人員就借用了Tn5的這個特點將其用於文庫構建。

對其中細節感興趣的讀者可以打開圖注中的鏈接仔細研究。


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