數字PCR(digital polymerase chain reaction,dPCR)作為DNA定量的新技術,實現了單分子DNA絕對定量。dPCR是將單個DNA樣品反應液分別進行數以百計的反應,並且每個反應分別進行擴增檢測. 此技術在臨床診斷、轉基因成分定量、單細胞基因表達、環境微生物檢測和下一代測序等方面的研究發揮了重要作用。BEAMing技術:結合了數字PCR以及流式技術,最早是由Bert Vogelstein提出。其方法是每一類DNA分子都會專一的與磁性珠相連接,然后DNA分子之間的差異可以通過流式細胞儀檢測熒光標記來做出評估。這種方法是基於小珠(Bead)、乳濁液(Emulsion)、擴增(Amplification)、磁性(Magnetic),這四個主要組分來構建的,所以被稱作為BEAMing。
BEAMing技術應用優勢:
(一)在常規實驗室條件下,數以萬計的DNA分子可以通過該種方法來進行評估。
(二)特異的突變可以通過流式細胞儀進行分離篩選以備進一步分析和研究。
(三)BEAMing技術可以用來對特定組織或者人群中罕見的突變,以及研究一般基因序列或轉錄的產物的變異都可以提供相應的鑒別和定量分析。
BEAMing技術步驟
步驟1:包被鏈霉親和素磁珠共價鍵結合的生物素標記的寡核苷酸(寡核苷酸)。
步驟2: PCR所需的所有成分和結合引物微球和模板DNA的水油溶液混合一起攪拌,創造微乳液。(水為白色小室,灰色為油)包含平均小於1個模板分子和小於一個微球。紅色和綠色的模板代表兩個模板分子,其中不同的一個或多個核苷酸的序列。
步驟3:微滴乳狀液進行的常規PCR溫度循環。如果DNA模板和微球在一個單一的水隔室中一起存在,微球結合的寡核苷酸作為引物進行擴增。連接到微球直標紅色和綠色的線代表從兩個不同的種模板的延伸產物。
步驟4:磁性分離微球(微球有磁性)。
第5步:變性后,將微球孵育能夠區分不同種模板的序列的寡核苷酸。然后熒光標記的抗體,用於標記綁定的雜交探針。激光激發后含有PCR產物的微球能夠發出紅色或綠色。
步驟6:流式細胞儀是用來計數的紅色和綠色的微球
