ALK FISH探針是FDA批准的用於檢測肺癌患者中ALK重排的方法，這些患者可能受益於ALK激酶抑制劑。FISH測定在技術上可能具有挑戰性並且難以解釋。已經有研究者提出以ALK免疫組織化學和下一代測序作為替代方法。在本研究中，我們比較了各種ALK-FISH模式與下一代測序（NGS）針對基因融合的檢測效果，以及ALK免疫組織化學（IHC）和腫瘤對克唑替尼的反應。在2116例肺腺癌樣本中，72例（4％）是ALK-FISH陽性，其中28個ALK-FISH陽性病例用於研究，包括15個分裂信號（54％），10個單個橙色信號（36％），和3個混合信號（10％）。12例（80％）分裂信號和4例（40％）單一橙色信號的病例為NGS和IHC陽性，混合信號病例均為陰性。不一致病例的突變分析顯示多個突變，包括EGFR，KRAS，BRAF和ATM基因。在具有分裂信號和混合信號的組中所有不一致病例顯示重排細胞數較低（平均28.5％；范圍20.5-36.9％）。在對克唑替尼的反應和FISH之間沒有觀察到統計學顯着關聯（p=0.73）。相比之下，NGS融合陽性病例對克唑替尼的反應好於NGS陰性病例（p=0.016）。我們的研究表明單獨使用ALK FISH可能不是檢測ALK基因重排最可靠的方法，可能應與ALK IHC和NGS並行使用檢測基因融合和突變。
方法
2116肺腺癌和具有腺癌組分的NSCLC患者，在2009-2013年在匹茲堡大學醫學中心通過FISH測試ALK重排，其中72例顯示為陽性，我們從中隨機選取28例進行對比研究。
免疫組織化學：使用UltraView DAB檢測試劑盒在BenchMark XT自動染色機上，使用抗ALK（D5F3）單抗在4μm厚的FFPE切片上進行ALK的免疫組織化學。
FISH檢測：ALK重排的FISH分析，使用ALK Break Apart FISH試劑盒和LSI ALK 5‘探針和LSI ALK 3’探針，雜交並與標准對照。
新一代測序：對於ALK融合的檢測，使用基於多重擴增子的靶向NGS測序，可檢測169個已知的基因融合，涉及19個靶基因和94個融合伴侶。
檢測突變和拷貝數變異：使用Ion AmpliSeq TM Cancer Panel測定。
結果
我們的研究表明在ALK重排狀態的評估和解釋中遇到困難和挑戰。ALK FISH測定目前是評估ALK基因重排的金標准，並且高度預測對克唑替尼的反應。
我們的觀察表明5‘刪除模式表示異質的腫瘤組，比分離信號的情況更容易出現假陽性結果。類似地，混合病例雖然數量有限，但其NGS和IHC檢測結果都是陰性的，並且顯示較低百分比的ALK陽性細胞。在決定ALK
靶向治療之前，可以在這兩組特定病例中考慮其他檢測方法，如NGS和IHC。
本研究中特別重要的是，NGS可以更可靠地選擇最可能響應克唑替尼的靶向治療的患者。這種情況進一步支持最近發表的觀點，肺癌中的致癌突變和基因重排不一定是相互排斥的。此外，我們的研究支持這樣的想法，肺癌應同時檢測大量的致癌突變，基因重排和可能的基因拷貝數變化，因為基因組異常是復雜的，可能影響腫瘤對靶向治療的反應。各種NGS平台具有在小腫瘤樣品上同時檢測許多基因組異常的巨大優勢，並且提供對腫瘤突變負擔的更好理解，其可以具有很好的預測和預后意義。因此，我們認為，NGS方法應當成為臨床實踐中肺癌檢測的標准方法。
結論
總之，我們的研究表明ALK FISH可能不是評估肺癌ALK基因重排的最可靠的方法。由於ALK IHC顯示出與基因融合的存在高度一致性，因此它應該被認為是ALK FISH的替代方法，並且可能是更具成本效益的初始篩選方法。如果實驗室不采用NGS，而是決定並行運行ALK IHC和ALK FISH用於融合
基因檢測，應該考慮不一致結果的情況。此外，目前的實踐建議不需要ALK FISH陽性模式的詳細報告，但是基於我們的觀察，FISH測定傾向於在具有單個橙色信號和混合信號組中顯示高比率的假陽性結果。因此，應該強烈地考慮各種FISH模式的詳細定量報告，因為它們可能暗示假陽性結果的存在，並促使病理學家進行額外的IHC或NGS檢測。我們的觀察應該在更大的一組患者中進行前瞻性驗證。
表1 基於NGS的ALK融合檢測和FISH檢測的總結
表2 NGS ALK融合陰性病例的突變分析
圖1 ALK FISH模式和ALK IHC的實例
A.ALK FISH融合和分裂信號與B.相應的強ALK IHC染色（放大20倍）；C.ALK FISH單一橙色信號和D.對應的ALK IHC弱染色（放大20倍）E.ALK FISH分裂模式與F.ALK IHC陰性染色（放大20倍）
圖2 對克唑替尼的響應和A.ALK FISH，B.NGS ALK融合檢測
信息來源：
Sanja Dacic, Liza C. Villaruz, Shira Abberbock, et.al. ALK FISH patterns and the detection of ALK fusions by next generation sequencing in lung adenocarcinoma. Oncotarget, Advance Publications 2016.