cutadapt 是一款質量過濾的軟件， 它可以刪除adapter, primer. polyA尾等序列；也可以用來去除低質量序列
源代碼： https://github.com/marcelm/cutadapt/
官方文檔：http://cutadapt.readthedocs.org/en/stable/
安裝：
git clone https://github.com/marcelm/cutadapt/
cd cutadapt
python setup.py build_ext -i
cd bin
export PATH=$PATH:$PWD
測試：
1） 去除3端引物序列
在建庫的過程中，會在DNA序列的3端加上對應的引物序列， 當測序儀的讀長read 過長時，比如建庫后的DNA fragement 長度是 200bp , 機器讀長是250bp, 機器從序列的5端開始測序，因為讀長大於序列長度，會讀到adapter 序列，測序得到的reads的3端就會包含引物序列，用法：
cutadapt -a AACCGGTT -o output.fastq input.fastq
-a 指定的是3端引物序列
去除3端
如果機器讀長大於fragment 的長度，會出現兩種情況；
1） 在測序得到的序列的3'末端會出現部分adapter 序列；
2）在3'末端有完整的adapter 序列，在adapter 序列之后還有其他隨機測到的序列；
input.fastq的內容如下：
@NB001 ATCATATCGATCTAGCCAACCGGTTACGA + ///////////////////////////// @NB002 ATCATATCGATCTAGCCAACCG + //////////////////////
3'端adapter 的序列為 AACCGGTT， 運行上述程序, output.fastq 的結果如下：
@NB001 ATCATATCGATCTAGCC + ///////////////// @NB002 ATCATATCGATCTAGCC + /////////////////
對上述兩種情況，cutadapt 會把adapter 序列都清除干凈
2）去除5'端引物序列
在建庫過程中，如果在5端添加adapter 序列， 也需要去除5端引物序列
通常情況下，5段引物序列位於序列的起始位置，但是當5端引物降解時，可能只有部分引物序列會出現在序列的起始位置；有時5段引物序列還會出現在序列中間，這時引物序列之前的序列都會被切掉
假設引物序列是ADAPTER, 測序得到的序列是 MYSEQUENCE, 5端引物可能出現的情況有以下幾種
ADAPTERMYSEQUENCE : 正常情況
DAPTERMYSEQUENCE ： 部分降解
TERMYSEQUENCE ： 降解嚴重
SOMETHING
ADAPTERMYSEQUENCE : 在5段接頭之前混入其他序列，接頭序列被污染
上面所有的情況，在切除5段引物時，這些污染序列都會被切除，只剩下正常的序列， 用法：
cutadapt -g AACCGGTT -o output.fastq input.fastq
input.fastq 的內容：
@NB001 AACCGGTTATCATATCGATCTAGCC + ///////////////////////// @NB002 CGGTTATCATATCGATCTAGCC + ////////////////////// @NB003 GTTATCATATCGATCTAGCC + //////////////////// @NB004 ACGTAAACCGGTTATCATATCGATCTAGCC + //////////////////////////////
output.fastq 的內容：
@NB001 ATCATATCGATCTAGCC + ///////////////// @NB002 ATCATATCGATCTAGCC + ///////////////// @NB003 ATCATATCGATCTAGCC + ///////////////// @NB004 ATCATATCGATCTAGCC + /////////////////
可以看到所有的adapter 序列都被清除干凈了
有一種特殊的情況叫做 Anchored adapter , 就是說只有當在reads的3’或者5'端出現長度一致的序列時，才認定這是一段adapter 序列，才會進行相應的去除adapter 序列的操作；
3） 去除barcode 序列或者兼並引物的序列
cutadapt 允許采用IUPAC 的鹼基字符表
字母N代表任意鹼基， 在去除barcode 序列是非常有用， 比如 ACGTANNNNNTAC 其中NNNN 代表barcode 序列， 又叫做index 序列
cutadapt -a ACGTAANNNNTTAGC -o output.fastq input.fastq
兼並引物序列：YACGT； 就是說可能為 CACGT 或者 TACGT
cutadapt -a YACGT -o output.fastq input.fastq
5) 去除雙端測序數據的adapter 序列
用法：
cutadapt -a ADAPTER_FWD -A ADAPTER_REV -o out.1.fastq -p out.2.fastq reads.1.fastq reads.2.fastq
備注：
cutadapt 在搜尋引物時， 默認允許錯配和插入缺失， 比如
adapter 序列是ADAPTER, 此時
ADABTER 有一個錯配，也會被剪切掉
ADAPTR 有一個缺失，deletion ,也會被剪切掉
ADAPPTER 有一個插入，也會被剪切掉
可以采用-e 指定錯配的比例， 默認-e 為0.1， 比如adapter 序列長度為9，允許的錯配數為 9 * 0.1 = 0.9, 然后直接向下取整后為0， 所以允許的錯配數為0；
可以采用-no-indels 來禁止插入和缺失，減少錯誤的剪切情況
因為cutadapt 允許部分匹配，比如 adapter 序列為ADAPTER ， 測序得到的 序列為ATCGATGCTADCGAGCGC，在序列的中間位置AD是adapter 序列的一部分， 此時會把AD以及之后的序列全部剪切掉，這種情況就屬於錯誤的剪切，所以cutadapt 默認必須至少有3個鹼基匹配時才會認為是adapter 序列，然后進行切除， 這個參數可以通過 --overlap 參數來指定默認的3適合絕大多數的情況
6) 去除低質量序列
使用-q/--trim-qualities 過濾低質量序列， 在去除adapter序列之前就開始過濾低質量序列；默認使用phred quality+33 的方式識別序列質量，如果為phred quality+64的方式，則添加--quality-base=64 參數
用法：
cutadapt -q 10 -o output.fastq input.fastq
默認只過濾3端的低質量序列， 如果想要過濾5端低質量序列，需要用逗號隔開
cutadapt -q 15,10 -o output.fastq input.fastq
5端用15進行過濾，3端用10進行過濾
質量過濾的算法
cutadapt 使用的質量過濾的算法和bwa 一致，假設一段序列質量編碼為
42, 40, 26, 27, 8, 7, 11, 4, 2, 3
質量過濾的閾值為10，則首先減去10
32, 30, 16, 17, -2, -3, 1, -6, -8, -7
從末端開始累加，
(70), (38), 8, -8, -25, -23, -20, -21, -15, -7
因為-25 最小，所以保留-25 之前的鹼基， 即保留前4位鹼基
7） 去除polyA 尾的序列
當adapter 序列中包含重復序列時，推薦使用A{10}這種寫法， 代表10個A，所以可以用來去除序列末端的polyA尾，用法：
cutadapt -a "A{10}" -o output.fastq input.fastq
注意的是，當序列末尾出現10個或者10個以上的A時，都會被去除
input.fastq 的內容：
@NB001 AACCGGTTATCATATCGATCTAGCCAAAAAAAAAA + /////////////////////////////////// @NB002 AACCGGTTATCATATCGATCTAGCCAAAAAAAAAAAAAA + ///////////////////////////////////////
output.fastq的內容：
@NB001 AACCGGTTATCATATCGATCTAGCC + ///////////////////////// @NB002 AACCGGTTATCATATCGATCTAGCC + /////////////////////////
可以看到，序列末尾的polyA尾全部被去除了
8） 從序列兩端切除固定長度的序列
cutadapt 還可以在序列的3端和5端切除固定長度的序列，使用-u/--cut 參數， 當值為正數時，從序列開頭切除， 當值為負數時，從序列末端開始切除
從序列開頭切除5bp，用法：
cutadapt -u 5 -o output.fastq input.fastq
input.fastq 的內容：
@NB001
ATGCATGCTAGC
+
////////////
output.fastq的內容：
@NB001 TGCTAGC + ///////
從序列末端切除5bp，用法：
cutadapt -u -5 -o output.fastq input.fastq
input.fastq 的內容：
@NB001
ATGCATGCTAGC
+
////////////
output.fastq的內容：
@NB001 ATGCATG + ///////
9） cutadapt 的其他參數
--length_tag 在輸出文件中給出 序列的length 信息
>read1 length=10
ACGTACGTAC
filter reads
-m N/ --minimum-length N 去除序列長度低於N的read
--too-short-output file 將序列長度低於N的read 輸出到文件中
-M N/ --maximum-length N 去除長度大於N的read
--too-long-output file 將序列長度大於N的read 輸出到文件中
--discard-trimmed 去除出現adapter 序列的read
--untrimed-output 將沒有進行出現過adapter 的序列單獨輸出到一個文件中
--discard-untrimmed 去除沒有出現過adapter序列的read
cutadapt 的處理順序：