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1. 下載安裝包：
nextflow可以通過bioconda安裝，所以這次我們只需要下載nf-core/rnaseq的安裝包即可：
mamba create -n nextflow nextflow nf-core conda activate nextflow nf-core download nf-core/rnaseq tar -zxvf nf-core-rnaseq-3.4.tar.gz
此時我們可以通過nextflow運行這個安裝包：
nextflow run nf-core-rnaseq-3.6/workflow/ \ # 格式就是nextflow run <下載好的nf-core-rnaseq文件夾下workflow文件夾的目錄>
--input samplesheet.csv \ # 就是上一步我們用python腳本生成的samplesheet.csv文件
--fasta Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa \ # 參考基因組所在的目錄
--transcript_fasta gencode.v38.transcripts.fa \ # 參考轉錄組所在的目錄
--gtf gencode.v38.annotation.gtf \ # 基因組注釋文件所在的目錄
--gencode \ # 強調GTF文件的格式是GENCODE的，因為從ENSEMBL和GENCODE下載 的GTF文件格式會略有不同
--aligner hisat2 \ # 默認的比對和定量軟件是STAR+Salmon，但是STAR真的是太耗內 存了，幾百G都有可能，跑着跑着就core dumped了，所以內存不夠的就用hisat2吧
--hisat2_index /genome/index/hisat2 \ # 可以不寫這個參數，pipeline會自己構建索引，就是比較慢
--splicesites gencode.v38.annotation.splice_sites.txt \ # 可以不寫，pipeline會利用上面的python腳本自己生成
--skip_qualimap \ # 因為qualimap是用於外顯子測序的質控的，如果不跳過就會報錯
--save_reference \ # 如果沒有提供現成的hisat2_index/salmon_index等，可以在此次運算后將index保存下來
-profile singularity # 用singularity容器運行，省心又省力
按照這個測試了一下發現不行，有一步會報錯。這時候有兩種可能，一種是我的數據不對，可能是存在不配對的reads導致出現這個問題我重新換了數據，發現還是不對。另一種可能是這個本地的鏡像在運行時會有問題，所以我重新使用了雲版本的nf-core，代碼如下：
nextflow run nf-core/rnaseq -profile singularity --input samplesheet.csv \
--fasta refrence.fasta \
--gtf 'refrence.gtf' \
--aligner hisat2 \
--skip_qualimap --outdir ./test5 --max_memory 60.GB --max_cpus 32 -r 3.6
一次跑通非常開心。
這里有這樣幾個點，參考基因組需要normalized，每行需要相同的鹼基，有的參考基因組需要使用picard工具重新normalize一下。
其次參考基因組的gff最號轉成gtf，我首先提取了primary transcripts然后將gff文件使用gffread轉化為gtf。
測序文件可以直接用fastq-dump來注釋：
fastq-dunmp --gzip --split-3 SRR.sra
此處注意fastq-dump一般推薦使用--split-3這個拆分方法，另外，加上--gzip就可以直接獲得壓縮格式的文件。