需提取14個樣品RNA,全部工作流程如下:
前期准備工作:
1.分別清洗14個研缽、研磨棒、金屬勺子,清洗完成后用衛生紙擦干,隨后用錫紙將研缽、研磨棒、勺子包住並,並滅菌備用;
2.裝一盒藍槍頭(1000μ),一盒黃槍頭(200μ),一盒白槍頭(10μ),並用報紙包裹住,滅菌備用;
3.帶上錫紙,裝液氮,在田間取樣后立刻用錫紙包裹住樣品,並置於液氮中備用;
RNA的提取:
1.將樣品置於研缽中,倒入液氮(可用紙杯分裝液氮),用研磨棒將樣品研磨成粉末狀,取研磨后的粉末加入600μ裂解液SG和10μProteinase K,立即渦旋劇烈震盪混勻,混勻后室溫放置5min;
2.12000 rpm離心2min,取約500μ上清進行以下操作
注意:槍頭盡量不要觸碰到沉淀底部,以免吸到雜質
3.將得到的上清加入基因組DNA去除柱中,12000rpm離心30s,保留濾液;
4.向上述濾液中緩慢加入0.5倍上清體積的無水乙醇(約250μ),混勻,得到的溶液和沉淀一起轉入RNase—Free吸附柱CR4中(吸附柱放在收集管中),12000 rpm離心30S,棄掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中;
5.不進行DNase Ⅰ消化,直接向RNase—Free吸附柱CR4中加入700μ去蛋白液RW3,12000 rpm 離心30S,棄廢液,將吸附柱放回收集管中;
6.向RNase—Free吸附柱CR4中加入500μ漂洗液RW,漂洗液RW在使用前需要加入無水乙醇,室溫靜置2min,12000 rpm 離心30-60S,棄廢液,將吸附柱放回收集管中;
7.重復步驟6;
8.12000 rpm 離心2min,倒掉廢液。將RNase—Free吸附柱CR4置於室溫放置2min,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液(注意:此步驟目的是將RNase—Free吸附柱CR4中殘余的漂洗液去除,漂洗液的殘留,可能會影響后續的RT等實驗。)
9.將RNase—Free吸附柱CR4轉入一個新的RNase—Free離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加30-100μ RNase—Free H2O,室溫放置2min,12000 rpm 離心2min,得到RNA溶液
注意:洗脫緩沖液體積不應該少於30μ,體積過小影響回收效率。RNA溶液請於-70℃保存