角膜營養不良（Corneal dystrophies，CD）是一類與遺傳有關的原發性角膜疾病，以雙眼對稱性緩慢進行的角膜透明度喪失為典型臨床表現，常導致復發性角膜糜爛和視覺損傷。Thiel-Behnke corneal dystrophy (TBCD) 由Thiel和Behnke於1967年發現，又稱為蜂窩狀角膜營養不良，是一種多與TGFBI基因突變相關的常染色體顯性遺傳病。致病性TGFBI基因突變，可使TGFBIp溶解性和穩定性發生改變，異常沉積在角膜基質細胞內及細胞外基質，最終導致角膜渾濁。目前，臨床上尚無有效的葯物及基因治療，角膜移植手術仍是角膜營養不良患者唯一有效的治療方法。
2021年7月7日，哈爾濱醫科大學附屬第一醫院眼科劉平教授實驗團隊在Autophagy（IF：16.016）雜志發表了題目為 “Torin 1 alleviates impairment of TFEB-mediated lysosomal biogenesis and autophagy in TGFBI (p.G623_H626del)-linked Thiel-Behnke corneal dystrophy” 的研究成果。文章首次報道了一個TBCD相關TGFBI基因的新框內突變類型(c.1868-1879del)，並深入探討了該疾病的發病機制，發現Torin 1通過抑制mTOR促進TFEB的去磷酸化，增加溶酶體功能，使受阻的自噬流增強，從而促進沉積的mut-TGFBI蛋白降解。景傑生物為該研究提供了蛋白質組學分析的技術支持以及蛋白質修飾泛抗體（PTM-1107，泛素化。
劉平教授團隊在研究中發現五種TGFBI相關CD基因突變型，包括一種12個鹼基缺失TGFBI基因新突變型：623位甘氨酸突變為纈氨酸后框內突變（TGFBI-p.Gly623_His626del.），TGFBI蛋白在突變后蛋白質的空間構象改變，可能引起其理化性質以及可溶性等的變化。另外通過構建的Tgfbi-p.Gly623_Tyr626del突變小鼠模型再現了CD疾病表型。
圖1. Tgfbi-p.Gly623_Tyr626del小鼠模型的建立及小鼠角膜組織的特征
本研究發現，與正常人角膜基質細胞相比，TGFBI-p.Gly623_His626del突變組人角膜基質細胞TGFBIp顯著增加，細胞形態也發生明顯改變。透射電鏡觀察顯示，突變角膜基質細胞內大量電子致密物質沉積、自噬小體增多、溶酶體病理性膨脹及胞質囊泡樣改變。結果提示細胞內mut-TGFBIp蓄積和自噬通路改變是TGFBI-p.Gly623_His626del相關TBCD疾病的重要病理特點。與正常組相比，TGFBI-p.Gly623_His626del突變組人角膜基質細胞內泛素化相關蛋白無顯著差異，而自噬相關蛋白LC3II及p62均升高，表明自噬起始正常，但下游不通，自噬流受阻。
圖2. TBCD患者角膜基質細胞中發生TGFBIp沉積及自噬流的阻塞
溶酶體是一種由細胞質膜封閉的細胞器，含有降解大分子和細胞成分的水解酶-組織蛋白酶，是自噬-溶酶體途徑的最終降解場所。許多因素調節溶酶體功能和隨后的蛋白質降解，包括腔內pH和蛋白水解酶活性，溶酶體功能障礙可能會引發嚴重的后果。研究人員檢測正常角膜基質細胞和TGFBI-p.Gly623_His626del突變角膜基質細胞中溶酶體功能狀況，發現突變組細胞溶酶體明顯鹼化，功能異常。為明確TGFBI-p.Gly623_His626del突變角膜基質細胞溶酶體蛋白水解酶變化，本研究通過蛋白質組學方法，共鑒定到6228個蛋白，其中CTSD（cathepsin D）表達顯著下調，這表明TGFBI相關CD疾病角膜基質細胞內溶酶體功能障礙是使自噬流發生阻塞的關鍵環節。
圖3. TBCD患者角膜基質細胞中溶酶體功能及溶酶體酶異常
轉錄因子EB（Transcription factor EB, TFEB）是自噬過程以及溶酶體生物發生的重要調節因子，在溶酶體表面，TFEB與mTOR相互作用並被磷酸化失活。因此，抑制mTOR，可促進TFEB去磷酸化，使其向細胞核易位，增強自噬功能及溶酶體蛋白的轉錄合成，溶酶體底物降解。本項研究發現，TBCD角膜基質細胞中Torin 1增強自噬及CTSD的表達，mTOR抑制劑Torin 1可以通過提高TFEB的活性，改善TBCD患病家系中溶酶體的鹼化以及蛋白水解酶的表達含量，增強自噬活性，促進沉積的TGFBIp的降解。
圖4. Torin 1 能夠恢復TBCD患者角膜基質細胞內溶酶體的功能
圖5. TFEB與MTORC1復合物和溶酶體功能障礙在TBCD自噬途徑中的相互作用模型
研究人員總結了以溶酶體鹼化導致自噬流受阻和CTSD缺乏為特征的TBCD可能的致病分子機制，提出了TFEB與MTORC1復合物和溶酶體功能障礙在TBCD自噬途徑中的相互作用模型。本研究加深和拓展了我們對TGFBI相關CD發病機制的認識和了解，從溶酶體視角揭示TGFBI相關CD發病新機制。
此外，劉平教授實驗團隊在2020年9月12日，在Cell Death Discovery雜志發表的題為 “Impairment of the autophagy-lysosomal pathway and activation of pyroptosis in macular corneal dystrophy” 的研究文章，首次報道了斑狀角膜營養不良（MCD）相關CHST6基因新穎的突變類型：c.290-291insG，並進一步闡釋了該疾病的發病機制：在斑狀角膜營養不良中，自噬流的阻塞、溶酶體功能的紊亂以及細胞焦亡途徑的激活，都可能和未硫酸化的硫酸角質素的沉積有關，並且最終導致了斑狀角膜營養不良的角膜渾濁。在MCD角膜基質細胞中，自噬小體和溶酶體可以進行融合，阻塞的自噬流可能是由於溶酶體功能紊亂所導致的；並且受損的自噬溶酶體途徑可能激活細胞焦亡信號通路；而caspase-1抑制劑（Ac-YVAD-CMK）可以改善MCD角膜基質細胞發生焦亡的情況。
以上研究成果加深和拓展了我們對CD發病機制的認識，從自噬-溶酶體視角揭示CD發病新機制，發現治療新靶點，使得早日在臨床治療中應用更為特異有效的治療方法成為可能。
參考文獻:
1. Tao Zheng, et al., 2020, Impairment of the autophagy-lysosomal pathway and activation of pyroptosis in macular corneal dystrophy. Cell Death Discovery.
2. Liyuan Wang, et al., 2021, Torin 1 alleviates impairment of TFEB-mediated lysosomal biogenesis and autophagy in TGFBI (p.G623_H626del)-linked Thiel-Behnke corneal dystrophy. Autophagy.