熒光是指一種光致發光的現象。當某種常溫物質經某種波長的入射光照射，吸收光能后分子中的電子達到高的能階，進入激發狀態，並且立即退激發，恢復到原有的狀態，同時多余的能量就以光的形式輻射出來，即發出比入射光的波長更長的發射光（通常在可見光波段）。一旦停止入射光，發光現象也隨之立即消失。這就是說，當一個物體吸收了短波光的能量，它能發射出比原來吸收的波長更長的光。具有這種性質的物質或者分子稱為熒光素或熒光染料。
當激光光束與細胞正交時，一般會產生兩種熒光信號。一種是細胞自身在激光照射下發出微弱的熒光信號，稱為細胞自發熒光；另一種是經過特異熒光素標記細胞后，受激發照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析就能了解所研究細胞參數的存在與定量。 如下圖，熒光產品示意圖：
（一）熒光信號的意義
熒光信號可以反映不同細胞的生物學特性。如用熒光染料標記的單克隆抗體特異的與細胞表面的抗原、受體或膜糖蛋白結合，在激光的激發下，發出一定波長的熒光。熒光信號的強度反映了膜抗原、受體或糖蛋白的相對數量，對熒光信號進行收集分析，就可以實現對細胞亞群和功能等的分析。用DNA染料對DNA進行染色，染料通過一定的方式與DNA鏈接合，在激光的激發下，染料發出熒光，測定熒光的強度，就可以得出相對的DNA含量，進而可對細胞周期時相進行分析。使用特定的熒光染料還可對細胞鈣離子濃度、細胞內PH以及細胞膜電位等進行測定。
（二）熒光染料的選擇
可選用的熒光染料多種多樣，由於他們的分子結構不同，其熒光激發譜與發射譜也各異。選擇染料或單抗所標記的熒光素必須考慮儀器所配置的激光光源的波長，即染料的激發光譜；儀器激光的激發光波長盡可能接近熒光染料的激發光譜峰值；此外，還要考慮熒光染料的發光顏色，即染料的發射光譜，需選擇合適波段的檢測器檢測相應的熒光信號。
由於現在的流式細胞儀都裝有多個熒光信號檢測器，儀器在同時檢測多種熒光時，每個熒光檢測器只允許一種指定波長的熒光信號進入並被檢測，因此使用者必須選用適當的熒光信號接收器，才能收到最佳的信號。還要注意使用由同一波長激光的熒光染料，其發射波長不同，才可以用相應波段的檢測器接收，達到同時檢測的目的。
選擇檢測器的依據就是要了解熒光染料的發射譜。以三色FCM為例，如果熒光光譜峰值落在綠色范圍（波長515-545nm），選用第一熒光檢測器；如果光譜值落在橙紅色范圍（564-606nm），選用第二熒光檢測器；如果熒光光譜值落在深紅色范圍（波長）650nm），選用第三熒光檢測器。目前台式FCM常配置的激光器為波長488nm，通常可用的染料有PI、PE、FITC、PERCP、CY5等。
（三）熒光標記抗體組合
在進行流式細胞儀多色分析時，如果想得到理想的分析結果，就需要選擇好抗體的熒光搭配。常考慮的影響因素有以下幾點。
1 熒光素的熒光強度
一個特定抗體，能否區分陰性與陽性結果，取決於該抗體用何種熒光素標記。每一種熒光素的光量子釋放能力不同，相對熒光強度不一樣，一般用染色指數（staining index）來比較不同熒光標記的光信號強度。染色指數是陽性信號和陰性信號差異與陰性峰分布寬度比值，是判斷該熒光染料辨別弱陽性表達的能力。如下圖顯示了用8種不同的熒光素標記相同的單克隆抗體，得到了不同的染色結果，我們需要從中尋找染色指數較高的熒光染料，去標記表達弱的信號。
由此可以看出：對於特定的單克隆抗體，由於使用了不同的熒光素標記，其陰性細胞核陽性細胞的S/N比值（信噪比）可以相差4-6倍。一般來講，熒光信號由強到弱的的排序是：PE>APC>PE-CY5>PERCP-CY5.5>FITC>PERCP。
在選擇熒光標記抗體時，需要綜合以下方面的因素：
熒光素標記效率：抗體上標記熒光素的數量（F/P）值也會影響相對熒光強度。每一個抗體上可標記幾個FITC或PERCP分子（通常為2-9個），而APC和PE的標記量約為每個抗體標記一個熒光分子。FITC為小分子化合物，而PE，PERCP和APC則是分子量較大的熒光蛋白。受熒光標記物的化學性質要求限制，IGM型抗體通常只用小分子的熒光素進行標記，如FITC、TEXAS RED、CY3和CY5。
抗體檢測的抗原密度：高表達的抗原幾乎可以用任何熒光素標記的抗體檢測，而較低表達的抗原則需要用較高S/N比值的熒光素標記的抗體檢測，從而達到有效區分陽性細胞群和陰性細胞的目的。
細胞自發熒光：每個細胞群體的自發熒光水平都不同，盡管可以觀察到高熒光強度的細胞，但自發熒光在高波長范圍里（>600nm）迅速降低。檢測自發熒光水平高的細胞時，使用發射光波長較長的熒光染料比如APC可以得到較好的S/N比值。如果是自發熒光水平不太高的細胞，那么，使用較長波長的激發光激發，對於提高陽性、陰性差別的現象影響不明顯。可以使用FITC標記的抗體。
2 非特異性結合
有些熒光標記的抗體會表現出低水平的非特異性結合，就會造成陰性細胞的熒光水平升高。這種非特異性結合通常由以下兩種因素造成：
單克隆抗體的同型對照：一些IGG型同型對照更易於某些類型的細胞的FC受體結合
使用的熒光素：有時CY3，CY5，CY5.5和Texas Red直接標記的抗體，以及某些tandom偶聯抗體，與某些細胞亞群的結合性增強。對於CY5來說，研究表明，這主要是由於染料與低親和性FC受體的弱相互作用造成的；PE-CY5標記的抗體也有類似作用。另外，在某些情況下（如用抗HLA-DG PE/抗單核細胞PerCP-CY5.5分析單核細胞），也可以利用這種特性，有意在標記抗體是增加CY染料的標記量，這樣就可以保證無論每個單核細胞的CD14表達水平的高低差別有多少，都可以檢測到單核細胞
總之，在進行流式細胞儀多色分析時，應慎重選擇熒光抗體標記的熒光染料。主要影響因素有：根據不同型號選擇適當的熒光抗體（激光功率和波長）；染色細胞的抗原表達的相對密度（對於低表達密度的抗原，應該選擇更亮的熒光染料）；陰性細胞上的FC受體情況。此外，做多色分析時，要盡量選擇熒光波普間的光譜重疊較小的熒光染料進行組合，同時需要正確的調整補償。
3.熒光補償的調節
當細胞攜帶兩種或者以上熒光素（比如PE和FITC），受激光激發而發射兩種以上不同波長的熒光時，理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應的檢測器檢測到，而不會檢測到另外一種熒光。但由於目前所使用的各種熒光染料都是寬發射譜性質，雖然他們之間各自發射的峰值不相同，但發射譜范圍有一定的重疊，因而少量不需要檢測的另一種熒光信號也會被此光電倍增管所檢測，所以每一個光電倍增管實際上檢測到都是兩種熒光之和，但各以某一種熒光為主。如圖可以看出，熒光素的發射波譜有一定范圍，其發射信號勢必會有極少部分進入到另一個檢測當中。圖中陰影為探測器檢測光譜的范圍，FITC探測器會檢測到少量的PE光譜，而PE光譜探測器檢測到較多的FITC光譜。
由於光譜重疊的部分占檢測信號的一定比例，因此，熒光補償的方法就是：從所接收的熒光信號中，把另一個檢測器中接收信號的一部分（即光譜重疊的部分）減去，使另一個檢測器信號在此檢測器中檢測的信號與陰性背景信號一致，這樣，該光電倍增管中輸出的信號真正只代表指定檢測的信號，而沒有另一波長的熒光信號的干擾。利用標准的已知單陽性樣本，可合理設置熒光信號的補償值。補償的程度可用雙熒光參數同時測定的儀器條件來決定。補償時先測定一種染料的熒光（FL1），此時除了應該接收該熒光的光電倍增管如FL1檢測器有信號輸出外，另一光電倍增管FL2檢測器也常會有微弱的輸出，調節補償器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與陰性信號一致；然后再測另一種染料（FL2），再調整補償器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與陰性信號一致。如此反復調節，則FL1和FL2檢測器就可全獲補償。
做多色分析時，必須分別使用各個熒光素單陽性的樣本做檢測，調整與其他各熒光通道的補償，以保證多色分析結果的准確性。由於多色分析熒光補償的復雜性，許多分析軟件都允許做脫機補償，這位操作者提供了很大的方便。
需要注意的是，補償與特定實驗的特定熒光素組合、特定儀器條件設置有關。當補償設定之后，如果PMT的電壓改變、激光波長變動、濾光片系統等有變化，熒光補償值就會有改變，需要重新調整補償。