多色熒光成像在生命科學領域是非常常見的一種研究手段。各種不同顏色的熒光探針如DAPI（藍色），GFP（綠色），mcherry（紅色），YFP（黃色）等與特定的蛋白結合，分別在不同的波長被激發，發射出不同顏色的熒光，從而幫助我們區分不同類型細胞或蛋白，研究它們的相互作用等。
傳統的多色熒光成像是通過控制濾色片轉盤切換不同的通道，分別拍攝熒光圖片，然后在軟件中將它們合成一張多色熒光圖像（圖 1）。但是機械部件的切換通常比較慢，尤其是對於活細胞成像來說，損失了大量時間，不能進行高速采集，無法捕捉到一些非常迅速的動態事件。
圖1 多色熒光成像示意
如何提高多色熒光成像的效率呢？本期顯微技術專題我們就給大家介紹多色熒光成像的一件神器——分光器。
首先，我們來聊聊什么是分光器。
什么是分光器？
談到分光器，大家應該並不陌生，它就是一個將一束光分成2束或多束的光學裝置。最常見形狀是一個立方體（Cube）（圖 2A-C），由兩個三角玻璃棱鏡膠合在一起組成，通過調整粘合層的厚度，從一面入射的光一半可以通過棱鏡繼續傳輸，另一半被反射（圖 2A）。另一種常見的形態是分光鏡，一片玻璃或塑料片的一面有非常薄的金屬塗層，厚度剛好可以實現50%的光透射，50%的光被反射（圖 2D）。我們常用的二向色鏡就是這種類型，只不過是用特殊的二向色光學塗層代替金屬塗層，可以將光束分成不同波長的兩束光。塗層的材料不同，反射/透射光的比例也不同。和cube相比，分光鏡可以允許更強的入射光，但cube更耐用更易操作。
圖2 分光器原理 （A）分光器原理，1 為入射光，2 為透射光，3 為反射光。（B）不同規格分光器大小示意。（C）（D）分光器cube和分光鏡。
為什么要用分光器？
了解了分光器的原理，下面我們來談談它如何讓我們的實驗變得簡單高效~
文章開頭我們就說過傳統的切換通道進行多色熒光成像的方法比較費時（圖 3a,b），而分光器就可以解決這個問題。試想一下，通道切換的步驟被省去了（圖 3c），通過二向色鏡和不同波長濾色片的結合，可以一次性同時對所有的通道成像！這不但大大節省了實驗時間，更適合長時間活細胞成像和高速成像。而且如果需要，還能實現熒光和明場同時成像，簡直一舉多得！
圖3 多色熒光成像的幾種方案。（a）切換不同的 cube，速度最慢（b）直接切換濾色片，速度比（a）稍快（c）使用分光器用兩台相機同時成像，速度最快。
那么，究竟如何將分光器用於多色熒光同步成像呢？有兩種方法：
- 只用一台相機成像，由視野的不同區域對單個通道成像
- 多台相機同時成像，每台相機對一個通道成像
下面我們就分別來介紹一下這兩種方法：
單相機同步多色成像
分光器連接在顯微鏡和相機之間，將入射光按不同的波長分成幾束，並投射到相機視野的不同區域進行成像，每個區域只對一種波長成像（圖 3）。如圖 4 所示，在一個2通道的分光器中，從樣品來的發射光通過二向色鏡被分成兩束波長不同的光（一般是長通短反），再通過幾組棱鏡的反射，投射到同一台相機芯片的左右兩邊。這樣相機的左右各一半視野就分別顯示同一樣品不同通道的熒光圖像。通過軟件合成就可以得到我們想要的多色熒光圖像。
圖3 雙通道分光器實現雙色熒光同步成像（Prime 95B）
通過增加二向色鏡和棱鏡的數量，就可以實現三通道甚至四通道的單相機多色成像。圖 5 向大家展示了 Carin Research 公司生產的雙通道分光器 OptoSplit II，三通道分光器 OptoSplit III 和四通道分光器 MultiSplit V2 用於單相機多色成像的效果。
圖5 雙通道（上），三通道（中）和四通道（下）分光器效果示意
這種方案不但省時省力，而且節省成本。許多高端的成像應用如 FRET，鈣離子/電壓成像，轉盤共聚焦和 TIRF 等都可以使用這種方案。以 TIRF 為例（圖 6），基於全內反射原理，樣品被照亮的部分很小（~100nm），與寬場熒光相比，雜散光更少，信噪比更好，特別適用於研究樣品靠近表面的區域。再加上TIRF曝光時間短、焦平面單一，常用於動態過程成像。分光器的加入可以使得多通道 TIRF 的速度更快（圖 6C），能夠響應非常快速的動態過程。
圖6 TIRF成像示意。（A）TIRF原理：在單個細胞中，由蓋玻片反射的光產生的倏逝場會激發離蓋玻片最近的一些熒光分子（綠色）（B）TIRF成像光路（C）雙色同步TIRF成像
但是，使用單相機的一個最主要的問題就是有效成像視野被大大縮小了，從圖5中大家也不難看出，雙通道同步成像的有效視野只有相機正常視野的1/2，通道越多視野越小，四通道就只有1/4。如果你想要拍攝比較大的樣品，就要在通道切換節省的時間和采集圖像增加的時間之中做個權衡了。這時候你有兩個選擇來解決這個沖突：第一個——選擇一個大視野的相機！如 Teledyne Photometrics 29mm 對角線視野 sCMOS Kinetix，四通道成像單個有效視野依然可以達到對角線 15mm，能夠滿足大部分樣品的要求（圖 7）。
圖7 Kinetix 四通道多色同步成像示意
第二個方法更加簡單粗暴——增加相機數量！
多相機同步多色成像
在單相機的方案中，我們需要把一台相機的視野分成幾個等分給不同的通道，那么直接用另外的相機來對不同通道成像不就好了嗎？如圖 8 所示，分光器將入射光分成兩束，透射光投射到一台相機，反射光投射到另一台相機進行成像。這就是 TwinCam 的工作原理：兩台相同的相機同時對同一樣品成像，每台相機只負責一個通道。還有同時使用四台相機的 MultiCam，在 TwinCam 的基礎上再增加一個二向色鏡，就可以進行四通道成像了。這種方案的好處是既能實現多色同時成像，又不會損失視野，當然價格會相對比較高。
圖8 TwinCam 和 MultiCam（Carin Research）原理示意（搭配 Prime 95B）
總的來說，分光器的使用不但改進了現有的多色熒光技術，也為開發一些新的成像技術提供了可能。作為連接顯微鏡和相機的橋梁，它能幫助研究人員們更好的控制光，大大增加了實驗的靈活性。