激活qiime2的執行環境：source activate qiime2-2019.4
如何查看conda已有的環境：conda info -e
以下分析流程參考：https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/qiime2-for-experienced-microbiome-researchers/
1、數據准備
現在我們常用的就是這種格式的數據，每個樣品一對數據文件
數據來源：https://docs.qiime2.org/2019.7/tutorials/importing/
wget \ -O "casava-18-paired-end-demultiplexed.zip" \ "https://data.qiime2.org/2019.4/tutorials/importing/casava-18-paired-end-demultiplexed.zip"
下載解壓后，文件夾中文件如下：
2、將數據轉換為qza格式（qiime新定義的自己的格式類型，有點編程中對象的含義）
qiime tools import \ --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \ --input-path casava-18-paired-end-demultiplexed \ --input-format CasavaOneEightSingleLanePerSampleDirFmt \ --output-path demux-paired-end.qza
3、查看數據質量
qiime demux summarize --i-data demux-paired-end.qza --o-visualization demux-summary-1.qzv
用以下命令查看結果：
qiime tools view demux-summary-1.qzv
4、雙端序列合並成單端
qiime vsearch join-pairs --i-demultiplexed-seqs demux-paired-end.qza --o-joined-sequences demux-joinded.qza
5、查看對merge后的數據質量情況
qiime demux summarize --i-data demux-joinded.qza --o-visualization demux-summary-merged.qzv
qiime tools view demux-summary-merged.qzv
##### 以下是使用dada2進行數據去噪，本教程先跳過該步，之后有專門教程介紹dada2使用
4、對數據進行剪切
雙端：
qiime dada2 denoise-paired \ --i-demultiplexed-seqs demux-paired-end.qza \ --p-trim-left-f 13 \ --p-trim-left-r 13 \ --p-trunc-len-f 150 \ --p-trunc-len-r 150 \ --o-table table.qza \ --o-representative-sequences rep-seqs.qza \ --o-denoising-stats denoising-stats.qza
單端：
qiime dada2 denoise-single \
--i-demultiplexed-seqs demux-joinded.qza \ #輸入應該也是序列，不能是joined對象 --p-trim-left 13 \ --p-trunc-len 150 \ --o-table table.qza \ --o-representative-sequences rep-seqs-merged.qza \ --o-denoising-stats denoising-stats-merged.qza
https://forum.qiime2.org/t/demultiplexing-and-trimming-adapters-from-reads-with-q2-cutadapt/2313
以下參考：
https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/86685524
https://mp.weixin.qq.com/s/6cLzyJjWQmHm82_U6euJ1g
5、序列質控
qiime quality-filter q-score-joined \
--i-demux demux-joinded.qza \
--o-filtered-sequences demux-joined-filtered.qza \
--o-filter-stats demux-joined-filter-stats.qza
輸出結果:
- demux-joined-filter-stats.qza: 統計結果
- demux-joined-filtered.qza: 數據過濾后結果
6、用deblur去冗余，並生成特征表（相當於QIIME1的OTU Table）
qiime deblur denoise-16S \
--i-demultiplexed-seqs demux-joined-filtered.qza \
--p-trim-length 250 \
--p-sample-stats \
--o-representative-sequences rep-seqs.qza \
--o-table table.qza \
--o-stats deblur-stats.qza
輸出結果:
- rep-seqs.qza: 代表序列
- deblur-stats.qza: 統計過程
- table.qza: 特征表
備注：
由於DADA2和Deblur產生的“OTU”是通過對唯一序列進行分組而創建的，因此這些OTU相當於來自QIIME 1的100%相似度的OTU，通常稱為序列變體。在QIIME 2中，這些OTU比QIIME 1默認的97%相似度聚類的OTU具有更高的分辨率，並且它們具有更高的質量，因為這些質量控制步驟比QIIME 1中實現更好。因此，與QIIME 1相比，可以對樣本的多樣性和分類組成進行更准確的估計。
7、查看deblur去冗余后的特征表
qiime feature-table summarize \
--i-table table.qza \
--o-visualization table.qzv
--m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv
qiime feature-table tabulate-seqs \
--i-data rep-seqs.qza \
--o-visualization rep-seqs.qzv
qiime tools view table.qzv
8、統計每個樣品包含的序列數
qiime deblur visualize-stats \
--i-deblur-stats deblur-stats.qza \
--o-visualization deblur-stats.qzv
qiime tools view deblur-stats.qzv
9、構建進化樹用於多樣性分析
qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
--i-sequences rep-seqs.qza \
--o-alignment aligned-rep-seqs.qza \
--o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
--o-tree unrooted-tree.qza \
--o-rooted-tree rooted-tree.qza
10、需要先准備一個metadata文件，文件說明參考：https://docs.qiime2.org/2019.7/tutorials/metadata/
11、計算核心多樣性
qiime diversity core-metrics-phylogenetic \
--i-phylogeny rooted-tree.qza \
--i-table table.qza \
--p-sampling-depth 500 \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \
--output-dir core-metrics-results
分析結果包含：
-
α多樣性
-
香農(Shannon’s)多樣性指數（群落豐富度的定量度量，即包括豐富度
richness和均勻度evenness兩個層面） -
Observed OTUs（群落豐富度的定性度量，只包括豐富度）
-
Faith’s系統發育多樣性（包含特征之間的系統發育關系的群落豐富度的定性度量）
-
均勻度（或 Pielou’s均勻度；群落均勻度的度量）
-
β多樣性
-
Jaccard距離（群落差異的定性度量，即只考慮種類，不考慮豐度）
-
Bray-Curtis距離（群落差異的定量度量）
-
非加權UniFrac距離（包含特征之間的系統發育關系的群落差異定性度量）
-
加權UniFrac距離（包含特征之間的系統發育關系的群落差異定量度量）
β多樣性分析結果-PCoA：
12、Alpha多樣性組間顯著性分析和可視化
qiime diversity alpha-group-significance \
--i-alpha-diversity core-metrics-results/faith_pd_vector.qza \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \
--o-visualization core-metrics-results/faith-pd-group-significance.qzv
qiime diversity alpha-group-significance \
--i-alpha-diversity core-metrics-results/evenness_vector.qza \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \
--o-visualization core-metrics-results/evenness-group-significance.qzv
13、繪制稀疏曲線
qiime diversity alpha-rarefaction \
--i-table table.qza \
--i-phylogeny rooted-tree.qza \
--p-max-depth 1000 \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \
--o-visualization alpha-rarefaction.qzv
--p-max-depth參數的值應該通過查看上面創建的table.qzv文件中呈現的“每個樣本的測序量”信息來確定。一般來說，選擇一個在中位數附近的值似乎很好用。
14、物種組成分析
下載物種注釋數據庫制作的分類器：
wget \
-O "gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza" \
"https://data.qiime2.org/2018.11/common/gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza"
物種注釋和可視化
qiime feature-classifier classify-sklearn \
--i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza \
--i-reads rep-seqs.qza \
--o-classification taxonomy.qza
qiime metadata tabulate \
--m-input-file taxonomy.qza \
--o-visualization taxonomy.qzv
生成物種組成柱狀圖：
qiime taxa barplot \
--i-table table.qza \
--i-taxonomy taxonomy.qza \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \
--o-visualization taxa-bar-plots.qzv
