Per tile sequence quality ---Position specific failures of flowcells
介紹
當Per tile sequence quality顯示fail或者warning，表明測序的lane或某個run中出現出現了部分故障，從而影響一些特定的區域和循環，進而使測序數據的質量下降。另外，如果read的3'端的質量是好的，就意味着存在瞬時質量損失(Transient quality loss)的區域難以被剪切處理。
Patterned Flow Cell Technology
| 設備 | Read sequences per lane | Read length | 設備運行時長 |
|---|---|---|---|
| HiSeq 2500 | 150 -180 million reads x 8 lanes | 100 bp single read or paired end | 5 days for single read 11 days for paired end |
| MiSeq | 12-15 million reads x 1 lane | 150 bp single read or paired end | 24-36 hours for both |
基本 Illumina NGS workflow
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文庫制備（library preparation）
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簇的生成（cluster generation）
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測序 (sequencing)
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比對和數據分析(alignment and data analysis)。
Illumina 測序方法的基本流程如下:
- A single base containing a fluorophore and 3' blocking moiety is incorporated by a polymerase.
- The flow cell is imaged using fluorescent microscopy.
- The fluorescent and blocking moieties are cleaved, allowing the next base to be incorporated.
flow cell 的結構
具有patterned flow cell 的測序技術的兩個突破性的創新點：
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a distinct, ordered nanowell design, Each nanowell contains DNA probes used to capture prepared DNA strands for amplification during cluster generation
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a new exclusion amplification chemistry
症狀和診斷
在illumina 的測序設備中，根據flow cell的表面，人為的將其切分為swaths，這些swaths再進一步被切分為tiles。 通過查看per tile，識別因flow cell 或 run的故障造成的測序的錯誤。
症狀一：random loss of quality at different positions and cycles
原因：overloading of the flow cell
症狀二：a broad loss of quality over 4 areas of the flowcell
原因：當run的總體質量有點略低，而flowcell並沒有過載時，造成這種錯誤的原因一般是由於測序的序列有偏差(biased)。這些高亮的區域代表flow cell 的邊邊，因為在flow cell 的邊邊，拍照系統識別read的信號的能力下降。一般而言，這些數據還不是太糟糕，常常還是能用的。
症狀三：a quality loss in specific areas which is not present from the start but remains for the remainder of the run
原因：拍照系統受到阻擋，比如說，有臟東西掉在flowcell的表面，或者一些東西被沖進了flowcell，並且卡在flowcell內。通常這種阻塞現象會成對出現，因為任何阻礙物都會影響swaths的頂端和底端，來自這些區域的序列通常在質控中能被修剪移除掉。
症狀四：a temporary loss of quality over a restricted area
原因：有些東西被沖進了flowcell中，阻塞了一些循環(cycles)，最后又被沖洗出去了。處理這個問題的難點在於，由於這段測序質量差的序列並不在read的末端，則意味着不能通過直接剪切處理這個read。
一般造成這個問題的主要原因是flowcell中的氣泡。同時，氣泡還會引起其他的副作用，如氣泡不僅阻止拍照系統正確拍照，還使測序試劑無法流入flowcell的納米孔中，進而無法形成cluster，從而導致氣泡下的cluster跳過了 sequencing chemistry cycles，使得在氣泡被引入之前的最后一個鹼基被重復讀取，最終導致序列被人為的延伸，即引入了插入片段。如果這些reads是用於檢測SNP的，那么這些假的插入片段將會混淆對下游分析結果解釋。
緩解上述症狀的方法
一般在下游分析時，flowcell中質量低的 tiles 是可被移除的。或者可以根據QC報告中tile position，過濾或移除fastqc文件中低質量的tile。
預防措施
除標准除氣和清潔工作程序之外，執行位置和一般質量檢查(positional and general quality checks)都會使用戶發現問題所在。
經驗教訓
即使是很小的數據子集，也有明顯的質量損失，因為它們有可能在下游分析中引入重要的生物噪聲。
軟件
FastQC per-tile quality plot 和 the BamQC per-base indel plot 會找出問題類型
參考鏈接：
Position specific failures of flowcells
Patterned Flow Cell Technology
https://www.broadinstitute.org/files/shared/illuminavids/sequencingSlides.pdf