Iso-seq , 全稱叫做 Isoform-sequencing, 是 Pacbio 公司對自己開發的轉錄本測序技術的規范化命名；是利用三代測序長讀長的特點，不打斷轉錄本，直接測序，從而得到全長轉錄本的一種測序技術。
對於iso-seq 的分析而言，必須掌握以下幾個基本概念：
1）ROI
了解過三代測序數據分析的人，對於CCS 環形一致性序列的概念肯定不會陌生，在iso-seq中，提出了比CCS 更加靈活的一個概念：ROI
ROI , 全稱 reads of insert，可以理解為插入片段，首先看下三代測序文庫構建階段的reads示意圖：
對於上述的文庫片段，測序產生的reads 示意圖如下：
由於是一個環狀分子， 隨着測序反應的進行，會循環測序；如果把插入片段的正負鏈都測了一次，就做1個full pass;
對於CCS 而言，要求至少有2個full pass , 才能去生成CCS reads; 三代測序的特點就是讀長很長，可以達到十幾kb, 對於短的插入片段而言，CCS這樣定義當然沒有問題，但是對於全長轉錄本
而言，轉錄本長度很長，比如轉錄本長度1kb, 讀長3kb, 此時在一個零模波導孔（ZMW）中測序的reads 就不可能達到2個full pass , 也就產生不了CCS reads, 為了解決這個問題，提高reads的利用率，提出了ROI 的概念，ROI 指的就是插入片段，上圖測序reads 產生的ROI 如下：
ROI 不要求滿足2個full pass， 相對CCS 而言，更加適合全長轉錄本的分析；
2）artifacts
可以理解為，共有兩種來源：
# Artificial Concatemer
這種序列是由於文庫制備階段，adapter 序列錯誤的將兩條轉錄本的序列鏈接構成了一個環狀分子，這個和adapter 濃度有關，通常這種reads 產生的比例很少，小於0.5%， 在后續的分析中，這部分reads 需要去除
# PCR Chimera
在PCR 反應中，由於不完全延伸的產物作為了下次擴增反應的引物，導致出現嵌合體序列，直觀上看，就是PCR產物來源於兩條或者多條reads；
PCR 產生的嵌合體序列，在PCR 反應體系中，這種序列是不可避免的，大約有3%的比例，在后續的分析過程中，可以借助軟件去除這部分reads；
3) FL Reads
FL , Full-length reads, 全長轉錄本
從raw data 到 ROI , 在從ROI 去除 artifacts reads 之后，我們就得到了用於后續分析的clean reads;
clean reads 就已經是轉錄本的序列了，我們首先看一下clean reads 當中，哪些是全長轉錄本；哪些不是全長轉錄本，這個操作就是分類，classify
全長轉錄本的示意圖如下：
對於全長轉錄本而言，其ROI reads 中包含5‘ primer 和 3‘ primer; 而且會出現polyA 為結構；（polyA 針對mRNA和部分lncRNA）
對於不同大小的文庫，其全長轉錄本的比例也不同：
可以看到，文庫片段越長，全長轉錄本的比例越低；
4） consensus transcript isoforms
一致性轉錄本序列，一個ZMW 產生一個轉錄本的reads, 肯定會有冗余的reads 出現，這是通過聚類（cluster）的方式，就全長轉錄本序列進行聚類，可以得到一致性的轉錄本序列；