基于ggpubr包为ggplot添加p值和显著性标记

这篇文章我们将讲述

1. 如何简单比较两组或多组的平均值
2. 如何自动化为ggplot添加p值和显著性标记，包括箱线图、点图、条形图、线图等等

准备

安装和导入所需要的R包

需要R包ggpubr，版本>0.1.3，该包提供了基于ggplot2包的论文发表级绘图。

• 从CRAN安装：

install.packages("ggpubr")

• 或者从GitHub上下载最新的开发版本：

if(!require(devtools)) install.packages("devtools") devtools::install_github("kassambara/ggpubr")

• 载入ggpubr：

library(ggpubr) #> Loading required package: ggplot2

ggpubr的官方文档在http://www.sthda.com/english/rpkgs/ggpubr ## 样例数据集

数据：ToothGrowth数据集

data("ToothGrowth") head(ToothGrowth) #> len supp dose #> 1 4.2 VC 0.5 #> 2 11.5 VC 0.5 #> 3 7.3 VC 0.5 #> 4 5.8 VC 0.5 #> 5 6.4 VC 0.5 #> 6 10.0 VC 0.5

比较均值的方法

http://www.sthda.com/english/wiki/comparing-means-in-r包含了均值方法比较的详细描述，这里我们汇总常见的均值比较方法：

方法	R 函数	描述
T检验	t.test()	比较两组 (参数)
Wilcoxon检验	wilcox.test()	比较两组 (非参数)
ANOVA	aov() or anova()	比较多组 (参数)
Kruskal-Wallis	kruskal.test()	比较多组 (非参数)

添加p值的函数

这里我们展示ggpubr包中可以使用的用于添加p值的R函数：

• compare_means()
• stat_compare_means()

compare_mean()

下一部分我们将实际学习使用，这里先具体介绍一下这个函数：

compare_means(formula, data, method="wilcox.test", paired=FALSE, group.by=NULL, ref.group = NULL, ...)

• formula: x~group形式的公式，x是一个数值向量，group是有1个或者多个组别的因子。比如formula = TP53 ~ cancer_group。也可以使用多个响应变量，比如formula = c(TP53, PTEN) ~ cancer_group。
• data: 包含变量的数据框
• method: 检验的类型。默认是wilcox.test。允许的值包括：
  • t.test和wilcox.test。
  • anova和kruskal.test。
• paired: 逻辑值，是否执行配对检验。仅能用于t.test和wilcox.test。
• group.by: 在执行检验前对数据集进行分组的变量。指定后，会根据该变量分不同子集进行检验。
• ref.group: 一个字符串，指定参考组。指定后，对于一个给定分组变量，每个分组水平都会和参考组进行比较。ref.group可以使用.all，这会对所有组别基于一个全局的均值进行两两比较。 ## stat_compare_means()

这个函数扩展了ggplot2，可以对指定ggplot图形添加均值比较的p值。

简单形式如下：

stat_compare_means(mapping = NULL, comparisons = NULL, hide.ns = FALSE, label = NULL, label.x = NULL, label.y = NULL)

• mapping: 由aes()创建的映射集合
• comparisons: 一个长度为2的向量列表。向量中元素都是x轴的两个名字或者2个对于感兴趣，要进行比较的整数索引
• hide.ns: 逻辑值，如果TRUE，隐藏不显著标记ns
• label: 指定标签类型的字符串。允许值包括p.signif（显示显著性水平），p.format（显示p值）
• label.x, label.y: 数值。用于摆放标签位置的坐标，如果太短，会循环重复。
• …: 其他传入compare_means()的参数，例如method,paired,ref.group

比较两个独立组别

执行检验：

compare_means(len ~ supp, data = ToothGrowth)
#> # A tibble: 1 x 8 #> .y. group1 group2 p p.adj p.format p.signif method #> <chr> <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr> <chr> <chr> #> 1 len OJ VC 0.0645 0.064 0.064 ns Wilcoxon

默认执行method="wilcox.test"，你可以指定method = "t.test"进行t检验。 返回一个包含下面列的数据框：

• .y: 用于检验的y变量
• p: p值
• p.adj: 矫正p值，默认矫正方法p.adjust.method="holm"
• p.format: 格式化p值
• p.signif: 显著性水平
• 方法： 用于比较组别的统计检验

创建一个带p值的箱线图：

p <- ggboxplot(ToothGrowth, x="supp", y = "len", color = "supp", palette = "jco", add = "jitter") # 添加p值 p + stat_compare_means()

# 改变方法 p + stat_compare_means(method = "t.test")

注意，p值标签位置可以使用label.x, label.y, hjust, vjust参数进行矫正。

默认p值标签显示是将compare_means()返回数据框的method和p列粘连到一起。你可以使用aes()函数进行组合。

比如，

• aes(label = ..p.format..) 或者 aes(label = paste0("p = ", ..p.format..)): 显示p值但不显示方法
• aes(label = ..p.signif..): 仅显示显著性水平
• aes(label = paste0(..method.., "\n", "p =", ..p.format..)) 使用在方法和p值中插入换行符

实际操作看看：

p + stat_compare_means(aes(label = ..p.signif..),
                       label.x = 1.5, label.y = 40)

也可以使用字符串指定标签：

p + stat_compare_means(label = "p.signif", label.x = 1.5, label.y = 40)

比较两组配对样本

执行检验：

compare_means(len ~ supp, data = ToothGrowth,
              paired = TRUE) #> # A tibble: 1 x 8 #> .y. group1 group2 p p.adj p.format p.signif method #> <chr> <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr> <chr> <chr> #> 1 len OJ VC 0.00431 0.0043 0.0043 ** Wilcoxon

使用ggpaired()函数可视化：

ggpaired(ToothGrowth, x="supp", y="len", color="supp", line.color="gray", line.size=0.4, palette = "jco") + stat_compare_means(paired = TRUE)

比较多组样本

• 全局检验

compare_means(len ~ dose, data = ToothGrowth,
              method = "anova") #> # A tibble: 1 x 6 #> .y. p p.adj p.format p.signif method #> <chr> <dbl> <dbl> <chr> <chr> <chr> #> 1 len 9.53e-16 9.50e-16 9.5e-16 **** Anova

用全局p值画图：

# 默认方法为 method = "kruskal.test" ggboxplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", color = "dose", palette = "jco") + stat_compare_means()

# 将方法改为anova ggboxplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", color = "dose", palette = "jco") + stat_compare_means(method = "anova")

• 成对比较，如果分组变量包含超过两个水平，配对检验会自动执行。

# 执行成对比较 compare_means(len ~ dose, data = ToothGrowth) #> # A tibble: 3 x 8 #> .y. group1 group2 p p.adj p.format p.signif method #> <chr> <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr> <chr> <chr> #> 1 len 0.5 1 0.00000702 0.000014 7.0e-06 **** Wilcoxon #> 2 len 0.5 2 0.0000000841 0.00000025 8.4e-08 **** Wilcoxon #> 3 len 1 2 0.000177 0.00018 0.00018 *** Wilcoxon

# 可视化： 指定你想要比较的组别 my_comparisons <- list(c("0.5","1"), c("1", "2"), c("0.5", "2")) ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", color="dose", palette = "jco") + stat_compare_means(comparisons = my_comparisons) + #添加成对p值 stat_compare_means(label.y = 50) # 添加全局p值 #> Warning in wilcox.test.default(c(4.2, 11.5, 7.3, 5.8, 6.4, 10, 11.2, 11.2, : #> cannot compute exact p-value with ties #> Warning in wilcox.test.default(c(4.2, 11.5, 7.3, 5.8, 6.4, 10, 11.2, 11.2, : #> cannot compute exact p-value with ties #> Warning in wilcox.test.default(c(16.5, 16.5, 15.2, 17.3, 22.5, 17.3, 13.6, : #> cannot compute exact p-value with ties

如果你想要指定精确的y轴位置，使用label.y参数：

ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", color="dose", palette = "jco") + stat_compare_means(comparisons = my_comparisons, label.y=c(29, 35, 40)) + stat_compare_means(label.y = 45) #> Warning in wilcox.test.default(c(4.2, 11.5, 7.3, 5.8, 6.4, 10, 11.2, 11.2, : #> cannot compute exact p-value with ties #> Warning in wilcox.test.default(c(4.2, 11.5, 7.3, 5.8, 6.4, 10, 11.2, 11.2, : #> cannot compute exact p-value with ties #> Warning in wilcox.test.default(c(16.5, 16.5, 15.2, 17.3, 22.5, 17.3, 13.6, : #> cannot compute exact p-value with ties

• 基于参考组的多重成对比较

# 基于参考组 compare_means(len ~ dose, data = ToothGrowth, ref.group = "0.5", method = "t.test") #> # A tibble: 2 x 8 #> .y. group1 group2 p p.adj p.format p.signif method #> <chr> <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr> <chr> <chr> #> 1 len 0.5 1 1.27e- 7 1.30e- 7 1.3e-07 **** T-test #> 2 len 0.5 2 4.40e-14 8.80e-14 4.4e-14 **** T-test

# 可视化 ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len", color="dose", palette = "jco") + stat_compare_means(method="anova", label.y=40) + stat_compare_means(label="p.signif", method="t.test", ref.group = "0.5")

• 以所有值为基准(base-mean)进行多个成对比较

如果出现很多组别，两两比较过于复杂，通过将所有数据汇总创建一个虚拟的样本，以它为基准进行比较。

# Comparison of each group against base-mean compare_means(len ~ dose, data = ToothGrowth, ref.group = ".all.", method = "t.test") #> # A tibble: 3 x 8 #> .y. group1 group2 p p.adj p.format p.signif method #> <chr> <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr> <chr> <chr> #> 1 len .all. 0.5 0.000000290 0.00000087 2.9e-07 **** T-test #> 2 len .all. 1 0.512 0.51 0.51 ns T-test #> 3 len .all. 2 0.000000425 0.00000087 4.3e-07 **** T-test

可视化

ggboxplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", color = "dose", palette = "jco")+ stat_compare_means(method = "anova", label.y = 40)+ # Add global p-value stat_compare_means(label = "p.signif", method = "t.test", ref.group = ".all.") # Pairwise comparison against all

这个方法有时候会非常有用，比如下面这个例子中，我们可以通过每个样本均值与所有样本的均值进行比较，判断基因水平是过表达还是下调了。

# Load myeloma data from GitHub myeloma <- read.delim("https://raw.githubusercontent.com/kassambara/data/master/myeloma.txt") # 执行检验 compare_means(DEPDC1 ~ molecular_group, data = myeloma, ref.group = ".all.", method = "t.test") #> # A tibble: 7 x 8 #> .y. group1 group2 p p.adj p.format p.signif method #> <chr> <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr> <chr> <chr> #> 1 DEPDC1 .all. Cyclin D-1 0.288 1.00e+0 0.29 ns T-test #> 2 DEPDC1 .all. Cyclin D-2 0.424 1.00e+0 0.42 ns T-test #> 3 DEPDC1 .all. MMSET 0.578 1.00e+0 0.58 ns T-test #> 4 DEPDC1 .all. MAF 0.254 1.00e+0 0.25 ns T-test #> 5 DEPDC1 .all. Hyperdiploid 0.0000000273 1.90e-7 2.7e-08 **** T-test #> 6 DEPDC1 .all. Proliferation 0.0000239 1.20e-4 2.4e-05 **** T-test #> 7 DEPDC1 .all. Low bone disease 0.00000526 3.20e-5 5.3e-06 **** T-test

可视化表达谱

ggboxplot(myeloma, x="molecular_group", y="DEPDC1", color="molecular_group", add="jitter", legend="none") + rotate_x_text(angle = 45) + geom_hline(yintercept = mean(myeloma$DEPDC1), linetype=2) + # 添加base mean的水平线 stat_compare_means(method = "anova", label.y = 1600)+ # Add global annova p-value stat_compare_means(label = "p.signif", method = "t.test", ref.group = ".all.") # Pairwise comparison against all

多个分组变量

• 根据某个变量分组后两个独立样本的比较

执行检验：

compare_means(len ~ supp, data = ToothGrowth,
              group.by = "dose") #> # A tibble: 3 x 9 #> dose .y. group1 group2 p p.adj p.format p.signif method #> <dbl> <chr> <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr> <chr> <chr> #> 1 0.5 len OJ VC 0.0232 0.046 0.023 * Wilcoxon #> 2 1 len OJ VC 0.00403 0.012 0.004 ** Wilcoxon #> 3 2 len OJ VC 1 1 1.000 ns Wilcoxon

因为生成了不同的子图，根据变量分面

# 根据 "dose" 变量分面绘制箱线图 p <- ggboxplot(ToothGrowth, x = "supp", y = "len", color = "supp", palette = "jco", add = "jitter", facet.by = "dose", short.panel.labs = FALSE) # Use only p.format as label. Remove method name. p + stat_compare_means(label = "p.format")

# Or use significance symbol as label p + stat_compare_means(label = "p.signif", label.x = 1.5)

将这几个图绘制在单个面板内：

p <- ggboxplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", color = "supp", palette = "jco", add = "jitter") p + stat_compare_means(aes(group = supp))

# 仅显示p值 p + stat_compare_means(aes(group = supp), label = "p.format")

# 使用显著性标记 p + stat_compare_means(aes(group = supp), label = "p.signif")

• 分组后配对样本比较

compare_means(len ~ supp, data = ToothGrowth,
              group.by = "dose", paired = TRUE) #> # A tibble: 3 x 9 #> dose .y. group1 group2 p p.adj p.format p.signif method #> <dbl> <chr> <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr> <chr> <chr> #> 1 0.5 len OJ VC 0.0330 0.066 0.033 * Wilcoxon #> 2 1 len OJ VC 0.0137 0.041 0.014 * Wilcoxon #> 3 2 len OJ VC 1 1 1.000 ns Wilcoxon

可视化，按分组变量dose分面创建一个多面板箱线图：

p <- ggpaired(ToothGrowth, x="supp", y="len", color="supp", palette = "jco", line.color = "grey", line.size =0.4, facet.by = "dose", short.panel.labs = FALSE) # Use only p.format as label. Remove method name. p + stat_compare_means(label = "p.format", paired = TRUE)

其他图形

• 条形图和线图（一组变量）

# 条形图加均值标准误 ggbarplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", add = "mean_se")+ stat_compare_means() + # Global p-value stat_compare_means(ref.group = "0.5", label = "p.signif", label.y = c(22, 29)) # compare to ref.group

# 线图加均值标准误 ggline(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", add = "mean_se")+ stat_compare_means() + # Global p-value stat_compare_means(ref.group = "0.5", label = "p.signif", label.y = c(22, 29)) 

• 条形图和线图（两组变量）

ggbarplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", add = "mean_se", color = "supp", palette = "jco", position = position_dodge(0.8))+ stat_compare_means(aes(group = supp), label = "p.signif", label.y = 29)

ggline(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", add = "mean_se", color = "supp", palette = "jco")+ stat_compare_means(aes(group = supp), label = "p.signif", label.y = c(16, 25, 29))

 

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